一种用于穿透多肽筛选的随机文库的构建及筛选

一种用于穿透多肽筛选的随机文库的构建及筛选

以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluo

rescence protein,EGFP)为示踪物,在pET-14b载体上构建编码12个氨基酸的随机多肽表达文库.建立一种简便、经济、有效的文库筛选方法,从所构建的文库中筛选出细胞穿透多肽(cell-penetrating peptide,CPP).采用点突变技术,首先在pET-14b载体多克隆位点Nde Ⅰ和Xho Ⅰ之间加入4个限制性内切酶位点,随后在BamHⅠ位点后加入三联终止密码子,接着再利用亚克隆的方法在Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ之间插入EGFP,形成一个新的用于原核表达示踪蛋白的载体pET-14bMCStop/EGFP.最后再利用点突变技术在上述构建的示踪载体的多克隆位点XhoⅠ和BamH Ⅰ之间插入36个随机碱基序列.以His-Tat-EGFP作为工具建立有效的筛选方法,利用这种方法对文库进行筛选.酶切和测序表明,示踪载体的构建是正确的,且在大肠杆菌中可有效地表达出His标记的EGFP.在示踪载体的基础上构建的随机多肽文库至少包含了105个独立克隆,其中90%以上的克隆插入的随机片段都是36个碱基.建立的筛选方法是可行的,并用此方法进行了初步的筛选.

作 者： 刘瑜 刘亚伟 李海玉 刘靖华 邓鹏 姜勇 LIU Yu LIU Ya-Wei LI Hai-Yu LIU Jing-Hua DENG Peng JIANG Yong 作者单位： 南方医科大学广东省功能蛋白质组学重点实验室和病理生理学教研室,广州,510515 刊 名： 中国生物化学与分子生物学报 ISTIC PKU 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY 年，卷(期)： 200622(6) 分类号： Q2 关键词： 细胞穿透多肽 随机多肽文库 跨膜转运 内化